Expresión y serorreactividad de la lipoproteína recombinante de 43-kDa de Bartonella bacilliformis / Expresión and seroreactivity of the recombinant Bartonella bacilliformis 43-kDa lipoprotein

Objetivo: La lipoproteína de 43-kDa de Bartonella bacilliformis fue obtenida en su forma recombinante (rBbLppB) ypurificada para evaluar su serorreactividad mediante ELISA. Materiales y métodos: Los niveles de anticuerpos IgG eIgM humanos en los sueros de pacientes con Bartonelosis confirmada y sueros de otras enfermedades (salmonelosis,Brucelosis y leptospirosis) frente a rBbLppB fueron evaluados por ELISA, se utilizó sueros de personas sanas comocontroles. Resultados: La sensibilidad y la especificidad del ELISA IgG fueron 70,4 y 90 respectivamente. Asimismo,la sensibilidad y especificidad de ELISA IgM fueron 85,2 y 90 respectivamente. Conclusiones: Estos resultadosdemuestran que el ELISA usando rBbLppB tiene una buena sensibilidad y especificidad y puede ser consideradacomo un buen antígeno para el diagnóstico de Bartonelosis causada por B. bacilliformis.

Objective: The Bartonella bacilliformis 43-kDa lipoprotein was obtained from its recombinant form (rBbLppB) and then, purified to evaluate sero-reactivity through ELISA. Material and methods: IgG and IgM humanantibodies levels in the sera of patients with confirmed Bartonellosis and sera of patients with other diseases (salmonellosis, Brucellosis and Leptospirosis), when contrasted with rBbLppB were evaluated by ELISA. Sera from some healthy people were used for controls. Results: Sensitivity and specificity of the IgG ELISA were 70,4% and 90% respectively. Also, sensitivity and specificity of the IgM ELISA were 85,2% and 90%, respectively. Conclusions: These results show that ELISA using rBbLppB is highly sensitive and specific and may be considered a good antigen for the diagnosis of Bartonellosis caused by B. bacilliformis.

Perfiles genéticos (IS6110) y patrones de resistencia en aislamientos de M. tuberculosis de pacientes con tuberculosis pulmonar. Lima Sur, Perú / Genetic profiling (RFLP-IS6110) and resistance pattern in M. tuberculosis isolates from patients with pulmonary tuberculosis, Southern Lima, Peru

Objetivos: Conocer los perfiles genéticos de M. tuberculosis y determinar el patrón de resistencia a drogas en una población de sujetos infectados provenientes del sur de Lima mediante el marcador genético IS6110 (RFLP-IS6110). Materiales y Métodos: entre octubre de 2002 y abril de 2003 se incluyeron pacientes mayores de 15 años con tuberculosis (TB) pulmonar frotis positivo procedentes de servicios de salud del distrito Villa María del Triunfo y delHospital María Auxiliadora. Se realizó la prueba de sensibilidad a las cuatro drogas de primera línea rifampicina (RIF), isoniacida (INH), estreptomicina (SM) y etambutol (EMB) por el método de proporciones, y la genotipificación mediante el método estándar de RFLP-IS6110. Se recolectó información de los casos de los registros del establecimiento e historias clínicas. Resultados: De 118 aislamientos de M. tuberculosis se identificaron 97 perfiles genéticos variandoentre 2 a 15 bandas por perfil. El 29,7 por ciento de los aislamientos dio origen a 14 grupos o clusters genéticos mientras que el resto mostró patrones variables de bandas. De otro lado, los perfiles de resistencia revelaron que cerca de 33 por ciento de los sujetos participantes nunca tratados presentaron resistencia a drogas y 58 por ciento de los tratados conanterioridad. La multidrogoresistencia fue de 8,42 por ciento y 36 por ciento en los nunca y anteriormente tratados respectivamente. Conclusiones: Nuestro análisis revela la existencia de grupos genéticos con relación epidemiológica o clonal sin evidencia de transmisión de cepas resistentes a múltiples drogas.

Objectives: To know the genetic profile of M. tuberculosis, and to determine its drug resistance pattern in apopulation consisting in infected subjects from southern Lima using the IS610 genetic marker (RFLP-IS6110). Materials and Methods: Between october 2002 and april 2003 patients older than 15 years of age diagnosed with pulmonary tuberculosis (TB) by a positive sputum smear were included. Patients were recruited from health facilities in Villa Maria del Triunfo district and Maria Auxiliadora Hospital. Susceptibility testing for all first-line drugs was performed: rifampin (RIF), isoniazid (INH), streptomycin (SM), and ethambutol (EMB) using the proportion method, and genotyping was performed using the standard RFLP-IS6110 method. Information was collected from case registries in health facilities, as well as from clinical records. Results: Out of 118 M. tuberculosis isolates, 97 genetic profiles were identified, with between 2 to 15 bands per profile. 29.7% of isolates originated 14 genetic groups or clusters, while the others showed variable patterns in their bands. On te other hand, resistance profiles revealed that nearly 33% of participating subjects who never received any previous therapy had drug resistance, as well as 58% of thosepreviously treated. Multidrug resistance was present in 8.42% and in 36% of those never before treated and thosepreviously treated, respectively. Conclusions: This analysis revealed the existence of epidemiologically- or clonallyrelated genetic groups with no evidence for multidrug resistant strains transmission.

Clonamiento, expresión y seroreactividad del antígeno recombinante flagelina de Bartonella bacilliformis / Cloning, expression and seroreactivity of recombinant antigen flagellin of Bartonella bacilliformis

Objetivos. Clonar el gen de la flagelina A (flaA) de Bartonella bacilliformis, expresar y evaluar preliminarmente la seroreactividad de la proteína recombinante a sueros de pacientes con Bartonelosis por B. bacilliformis. Materiales y Métodos. Se diseñó una pareja de oligonucleótidos iniciadores ûBbFlaA1 y BbFlaA2û para la amplificación del gen completo de la flagelina flaA de B. bacilliformis. El producto de amplificación obtenido se clonó en pGEM y luegose subclonó en el vector de expresión pGEX4T-1. Se indujo la expresión de la proteína de fusión rBbFlaA-GST con isopropil tio-β-D-galactosido (IPTG). La proteína de fusión producida fue digerida con trombina para liberarla de GST. Finalmente, una prueba de ELISA fue estandarizada para detectar los anticuerpos IgG contra la proteína de fusión rBbFlaA-GST y rBbflaA libre de GST. Se evaluaron sueros de pacientes con diagnóstico de Bartonelosis por B. bacilliformis (n= 30), sueros de individuos sanos (n= 20) y sueros de pacientes con otras enfermedades de posible reactividad cruzada; entre ellas, Brucelosis (n= 3), leptospirosis (n= 3) y salmonelosis (n=7). Resultados. Se determinó quepara la expresión óptima en E. coli BL21 de la proteína de fusión rBbFlaA se requiere que el cultivo crezca en caldo LB/ampicilina a 30 °C suplementado con 2 por ciento de glucosa a partir de un preinóculo de 100 μL (crecido por toda la noche), hasta que alcance una densidad óptica de 1 OD600 y se induzca por dos horas con 2,5 mM de IPTG. Finalmente, el 57,6 por ciento (17 de 30) sueros de pacientes con diagnóstico confirmado de bartonelosis reaccionaron con la proteínarecombinante BbFlaA en el formato de ELISA. Conclusiones. Se logró expresar exitosamente en E. coli la proteína recombinante BbFlaA de B. bacilliformis, determinándose un protocolo de expresión y de purificación de rBbFlaA para la producción de esta proteína. Así también, el antígeno rBbFlaA es reconocido por anticuerpos de sueros de pacientes con Bartonelo...

Objectives: To clone the Bartonella bacilliformis flagellin gene (flaA), and to preliminarily express and assess reactivity of the recombinant protein against B. bacilliformis bartonellosis patients' sera. Materials and Methods: A couple of initiating oligonucleotides was designed -BbFlaA1 and BbFlaA2- for complete B. bacilliformis flagelline A gene amplification. The amplification product obtained was cloned in pEGM, and later it was subcloned in pGEX4T-1 expression vector. Fusion protein rBbFlaA-GST expression was induced with isopropyl thio-β -D-galactoside (IPTG). The fusion protein produced was digested with thrombin in order to release its GST contents. Finally, an ELISA test was standardized in order to detect IgG antibodies against fusion protein rBbFlaA-GST and rBbflaA GST-free. Sera from patients with bartonellosis caused by B. bacilliformis (n= 30), sera from healthy individuals (n= 20), and sera from patients with a possible cross-reactivity; i.e., brucellosis (n= 3), leptospirosis (n= 3), and salmonellosis (n= 7) were assessed. Results: It was determined that for optimal expression of fusion protein rBbFlaA in E. coli BL21, it is required that the culture grows in LB/ampicillin broth at a 30º C temperature, supplemented with 2% glucose from a 100 µL pre-inoculum (left to grow overnight), until it reaches a 1 optical density (OD 600), and being induced for two hours at 2,5 mM IPTG. Finally, 57,6% (17 of 30) sera from patients with a confirmed bartonellosis diagnosis reacted with BbFlaA recombinant protein in an ELISA format. Conclusions: B. bacilliformis BbFlaA recombinant protein was successfully expressed in E. coli, and an rBbFlaA expression and purification protocol was determined for producing this protein. Also, rBbFlaA antigen is recognized by antibodies present in sera from bartonellosis patients infected with B. bacilliformis.

Perfiles genéticos (RFLP-IS6110) y resistencia a drogas en aislamientos de M. tuberculosis de pacientes internados en un hospital referencial del Callao, Perú / Genetic profiling (RFLP-IS6110) for drug resistance in M. tuberculosis isolates in institutionalized patients in a Reference Hospital in Callao, Peru

Objetivo: Evaluar la frecuencia de los perfiles genétics (RFLP-IS6110) y los niveles de resistencia a drogas en aislamientos de M. tuberculosis de pacientes hospitalizados con tuberculosis pulmonar frotis positivos (TBP-FP) en un hospital general de la provincia del Callao, Lima, Perú. Materiales y métodos: Se incluyeron pacientes con TBP-FP hospitalizados en el Hospital Nacional Daniel A. Carrión entre agosto del 2000 y febrero del 2001. Se realizó la prueba de sensibilidad a las cuatro drogas de primera línea (INH,RIF,SM,EMB) por el método de las proporciones y la genotificación mediante el método estandar de RFLP-IS6110. Se recolectó la información de los pacientes de los registros de laboratorio e historias clínicas. Resultados: En 74 aislamientos, el número de bandas en los perfiles genéticos variaron entre 2 y 16, 4 perfiles (5,5 por ciento) mostraron menos de 5 bandas. En total 50 perfiles genéticos fueron obtenidos de 70 pacientes. 34 aislamientos (48,6 por ciento) se agruparon en 14 "clusters" y 36 tuvieron ocurrencia única. La resistencia a drogas en pacientes nunca y antes tratados fue 45,2 por ciento y 71, 1 por ciento respectivamente. La multidrogorresistencia fue 16,1 por ciento y 36,8 por ciento respectivamente. 10 de los 14 "clusters" incluyeron por lo menos un aislamiento resistente y un cluster agrupó 6 aislamientos resistentes. Conclusiones: No se encontró evidencia de algún genotipo predominante en la población estudiada. Sin embargo se observaron "clusters" agrupando pacientes con TB sensibles y resistentes. Nuestros resultados sugieren que existen genotipos asociados a resistencia lo cual indicaría transmisión activa de cepas resistentes en la provincia del Callao. Es necesario llevar a cabo un estudio poblacional para confirmar nuestros resultados